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蛋白质多肽液相色谱纯化方法简介 液相色谱解决方案

时间:2025-04-17 20:33:33  来源:  作者:

蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介!rYH检测VBA
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1、纯化的一般目标和方法rYH检测VBA
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首先,自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如:匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。rYH检测VBA
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然后进行捕获色谱(capture chromatography),主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质,此步关心的是流速和载量,常采用高载量、快流速凝胶。rYH检测VBA
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经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography),目的是去除较难去除的杂质,此步关心的是分辨率,常采用高分辨率的细颗粒凝胶。rYH检测VBA
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后为了得到符合要求的终产品,去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断,进行精制色谱(polishing chromatography),常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。rYH检测VBA
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2、纯化前的准备工作rYH检测VBA
(1)样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性;b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性;c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性;d、测定样品在4-40℃的稳定性;e、室温下静置过夜,测定对蛋白水解酶的稳定性。rYH检测VBA
(2)样品预处理a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟)rYH检测VBA
b、去除样品中脂类( 10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提)rYH检测VBA
c、去除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)rYH检测VBA
d、抑制样品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第1步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白)rYH检测VBA
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(3)样品的保存条件:短期储存(小于24小时)rYH检测VBA
a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存(数天)rYH检测VBA
a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者hao冻干(真空冷冻干燥)保存。rYH检测VBA
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3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立 rYH检测VBA
a、目的蛋白含量测定酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。rYH检测VBA
b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法(考马斯亮兰G-250)等。rYH检测VBA
c、样品复杂度检测HPLC(离子交换、凝胶过滤、反相)、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳(CE)。rYH检测VBA
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4、蛋白质的来源rYH检测VBA
(1)天然蛋白: 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂,在分离过程中须采用多步骤才能去除各种杂质,并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。rYH检测VBA
(2)重组蛋白: 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位:rYH检测VBA
a、细胞质:在种情况下,必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质,同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放;在表达量较高的条件下,一般形成包涵体,包涵体含有过表达目的蛋白,且容易通过高速离心分离,但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。rYH检测VBA
b、外周质: 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间,这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。rYH检测VBA
c、分泌到培养基:这种表达一般蛋白质浓度较低,主要受到培养基中的污染。rYH检测VBA
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液相色谱填料流动相配制的特点

  液相色谱填料由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成,其中液相色谱柱的正确安装和使用,是液相色谱工作的关键;也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。rYH检测VBA

  液相色谱填料的使用过程中,若遇到使用不当的情况,会大大缩短色谱柱的使用寿命。为了延长色谱柱的使用寿命,应对色谱柱进行适当的保护。rYH检测VBA

  液相色谱填料是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点:rYH检测VBA

  a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。rYH检测VBA

  b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。rYH检测VBA

  c、流动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降,延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。rYH检测VBA

  d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用uv检测器,可以使用对紫外吸收较低的溶剂配制。rYH检测VBA

  e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进行。rYH检测VBA

  f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。rYH检测VBA

标签: 液相色谱
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高效液相色谱仪色谱柱性能的评价

  高效液相色谱仪色谱柱性能的评价包括评价内容和评价方法等方面。rYH检测VBA

  一、评价内容:rYH检测VBA

  1、分离效能。rYH检测VBA

  2、对指定溶质的选择性。rYH检测VBA

  3、在不同PH值介质中的稳定性。rYH检测VBA

  4、不同批次但同型号填料间性能的重现性。rYH检测VBA

  5、适宜的操作压力等。rYH检测VBA

  二、评价方法:rYH检测VBA

  以指定的一组标准溶质为样品,测定其在色谱柱上的理论塔板数,作为柱效的衡量指标。rYH检测VBA

  例:对于反相色谱填料,可以选择一组具有不同极性的芳香族化合物,如苯、萘、菲、苯、甲苯和二甲苯等作为基本组分,再加以苯酚和苯胺等酸、碱性溶质。rYH检测VBA

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