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液相色谱分析所有峰非常小解决办法 液相色谱常见问题解决方法

时间:2025-04-16 12:42:22  来源:  作者:
   当液相色谱仪分析中由于进样引起的所有峰非常小,甚至无峰的现象,可以转动手柄,观察手柄锁链的轴,根据观察现象进行排除:Jcn检测VBA
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1、如果轴不转动,旋钮总成在轴上打滑,解决办法是将手柄后部的两个固定螺丝拧紧在轴的平板上。第三个螺丝孔是用于进行轴上再定位的,因此只需要在任一位置拧紧两个螺丝即可。Jcn检测VBA
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2、如果轴转满60°,在进样位置,以冲洗方式充满针管,切换至取样并插入注射器(针管会出现少量溶剂)。一边进样,一边观察针管和放空管。Jcn检测VBA
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①如果进样时,溶剂流出针管,而放空管没有或只有很少量而得溶剂流出,说明样品溶液没有进入定量环,是针密封出故障或放空管堵塞;确认所用的针正确无误,如果放空管被堵塞,应对其进行清洁,按前述方法测试调节针密封。Jcn检测VBA
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②如果溶剂未从针管流出,而从放空管流出,说明样品溶液正在进入定量环,在取样位置时,转子密封圈吧的端口交叉划伤会导致流动相漏进定量环,置换出样品溶液。Jcn检测VBA
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确认方法:将5倍定量环体积的样品溶液冲入定量环并立即注射,这样,即使有液体漏入定量环,也至少要注射某些样品溶液,观察峰。再次进样。过一段是时间后切换至进样位置,使之有足够的时间泄露并置换出大量样品溶液,注射并观察峰。如果液相色谱仪峰小了很多,证明有泄露。如果泄露严重,需要在取样位置且注射器插入的状态下,观察放空管的泄露情况,解决办法是更换液相色谱仪转子密封圈。 

蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介!Jcn检测VBA
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1、纯化的一般目标和方法Jcn检测VBA
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首先,自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如:匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。Jcn检测VBA
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然后进行捕获色谱(capture chromatography),主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质,此步关心的是流速和载量,常采用高载量、快流速凝胶。Jcn检测VBA
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经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography),目的是去除较难去除的杂质,此步关心的是分辨率,常采用高分辨率的细颗粒凝胶。Jcn检测VBA
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后为了得到符合要求的终产品,去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断,进行精制色谱(polishing chromatography),常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。Jcn检测VBA
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2、纯化前的准备工作Jcn检测VBA
(1)样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性;b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性;c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性;d、测定样品在4-40℃的稳定性;e、室温下静置过夜,测定对蛋白水解酶的稳定性。Jcn检测VBA
(2)样品预处理a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟)Jcn检测VBA
b、去除样品中脂类( 10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提)Jcn检测VBA
c、去除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)Jcn检测VBA
d、抑制样品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第1步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白)Jcn检测VBA
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(3)样品的保存条件:短期储存(小于24小时)Jcn检测VBA
a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存(数天)Jcn检测VBA
a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者hao冻干(真空冷冻干燥)保存。Jcn检测VBA
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3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立 Jcn检测VBA
a、目的蛋白含量测定酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。Jcn检测VBA
b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法(考马斯亮兰G-250)等。Jcn检测VBA
c、样品复杂度检测HPLC(离子交换、凝胶过滤、反相)、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳(CE)。Jcn检测VBA
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4、蛋白质的来源Jcn检测VBA
(1)天然蛋白: 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂,在分离过程中须采用多步骤才能去除各种杂质,并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。Jcn检测VBA
(2)重组蛋白: 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位:Jcn检测VBA
a、细胞质:在种情况下,必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质,同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放;在表达量较高的条件下,一般形成包涵体,包涵体含有过表达目的蛋白,且容易通过高速离心分离,但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。Jcn检测VBA
b、外周质: 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间,这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。Jcn检测VBA
c、分泌到培养基:这种表达一般蛋白质浓度较低,主要受到培养基中的污染。Jcn检测VBA
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高效液相色谱仪高压输液系统

  高效液相色谱仪高压输液系统由贮液器、高压输液泵、过滤器、脱气装置和梯度洗脱装置等组成。Jcn检测VBA

  一、贮液器:Jcn检测VBA

  贮液器用来提供足够数量的符合要求的流动相,以完成分析工作。所有溶剂在放入贮液罐前必须经过0.45um滤膜过滤,除去溶剂中的机械杂质,以防输液管道和进样阀产生阻塞现象。Jcn检测VBA

  1、对贮液器的要求:Jcn检测VBA

  (1)必须有足够的容积,以备重复分析时保证供液。Jcn检测VBA

  (2)脱气方便。Jcn检测VBA

  (3)能耐一定的压力。Jcn检测VBA

  (4)所选用的材质对所使用的溶剂都是惰性的。Jcn检测VBA

  2、贮液器材质:Jcn检测VBA

  一般采用不锈钢、玻璃、聚四氟乙稀、特种塑料聚醚醚酮(PEEK)衬里为材料。Jcn检测VBA

  3、贮液器容积:Jcn检测VBA

  一般为0.5~2L为宜。Jcn检测VBA

  二、高压输液泵:Jcn检测VBA

  1、类型:Jcn检测VBA

  有恒流泵和恒压泵。Jcn检测VBA

  2、发展趋势:Jcn检测VBA

  (1)高效:填料颗粒小,分离效率高,柱压降大,泵工作压力大。Jcn检测VBA

  (2)分析时间短:流速更快,柱压降大。Jcn检测VBA

  (3)减少洗脱液用量。Jcn检测VBA

  (4)多元洗脱。Jcn检测VBA

  三、过滤器:Jcn检测VBA

  在高压输液泵的进口及它的出口与进样阀之间应设置过滤器。高压输液泵的活塞和进样阀阀芯的机械加工精密度非常高,微小的机械杂质进入流动相,会导致上述部件的损坏。同时,机械杂质在柱头上的积累会造成柱压升高,使色谱柱不能正常工作。常见的过滤器有溶剂过滤器和管道过滤器。Jcn检测VBA

  过滤器的滤芯采用不锈钢烧材料,孔径为2~3um,耐有机溶剂的侵蚀。若发现过滤器堵塞(发生流量减小现象),可将其浸入稀HNO3溶液中,在超声波清洗器中用超声波振荡10~15min,即可将堵塞的固体杂质洗出。若清洗后仍不能达到要求,则应更换滤芯。Jcn检测VBA

  四、脱气装置:Jcn检测VBA

  所有溶剂在使用前必须脱气。因为色谱柱是带压力操作的,而检测器是在常压下工作。若流动相中所含的空气不除去,则流动相通过色谱柱时其中的气泡受到压力而压缩,流出色谱柱后到检测器时因常压而将气泡释放出来,造成检测器噪声增大,使基线不稳,仪器不能正常工作。这在梯度洗脱时尤其突出。Jcn检测VBA

  脱气装置有离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气等装置。Jcn检测VBA

  五、梯度洗脱装置:Jcn检测VBA

  分低压梯度和高压梯度。Jcn检测VBA

标签: 高效液相色谱仪
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