保留时间不重现有两种不同的情况：既保留时间漂移和保留时间波动。前者是指保留时间仅沿单方向发生变化，而后者指保留时间无固定规律的波动。将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。如，保留时间的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上，保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所致）等。保留时间漂移的几种常见的原因如下： WUt检测VBA 一 色谱柱平衡 如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10-20个柱体积的流动相，但如果在流动相中加入少量添加剂（如离子对试剂）则需要相当长的时间来平衡色谱柱。 WUt检测VBA 流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。应注意：水是很容易污染的流动相成分。 WUt检测VBA 二 固定相稳定性 固定相的稳定性都是有限的，即使在推荐的PH范围内使用，固定相也会慢慢水解。例如，硅胶基质在pH4时水解稳定性更好。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定；长链键合相比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。 WUt检测VBA 经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解，如氨基键合相等。 WUt检测VBA 三 色谱柱污染 保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。 WUt检测VBA 样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质。如：配药中的赋形剂，生化样品（如血清）中的蛋白及类脂类化合物，食品样品中的淀粉，环境水样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量，在此情况下，保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。可以通过使用固相提取（SPE）等样品前处理方法来去除样品基质的影响。 WUt检测VBA 避免色谱柱污染简单的方法是防患于未然。相比之下，找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。如THF可去除反相色谱柱中的许多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色谱柱中的蛋白。 WUt检测VBA 使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。 WUt检测VBA 四 流动相组成 流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等。 WUt检测VBA 五 疏水坍塌 当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时，有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象，这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相，再用高水含量的流动相进行平衡。色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱（如Waters SymmetryShield RP色谱柱）或非端基封口的色谱柱（如Waters Resolve色谱柱）也可避免发生坍塌。WUt检测VBA （一）保留时间变化 ①柱温变化--柱恒温 ②等度与梯度间未能充分平衡--至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 ③缓冲液容量不够--用>25mmol/L的缓冲液 ④柱污染--每天冲洗柱 ⑤柱内条件变化--稳定进样条件,调节流动相 ⑥柱快达到寿命--采用保护柱WUt检测VBA （二）保留时间缩短 WUt检测VBA ①流速增加--检查泵,重新设定流速 WUt检测VBA ②样品超载--降低样品量 WUt检测VBA ③键合相流失--流动相PH值保持在3~7.5;检查柱的方向 WUt检测VBA ④流动相组成变化--防止流动相蒸发或沉淀 WUt检测VBA ⑤温度增加--柱恒温WUt检测VBA （三） 保留时间延长 WUt检测VBA ①流速下降--管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 WUt检测VBA ②硅胶柱上活性点变化--用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 WUt检测VBA ③键合相流失-- 同前（二）3 WUt检测VBA ④流动相组成变化--同前（二）4 WUt检测VBA ⑤温度降低--同前（二）5WUt检测VBA 异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。一般来说，异常峰是实验工作中较为棘手的问题。异常峰的出现会影响色谱分析的结果。通常情况下，峰型问题是由分离系统所决定的。在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。WUt检测VBA
1.色谱图中未出峰WUt检测VBA
系统未进样或样品分解;泵未输液或流动相使用不正确;检测器设置不正确WUt检测VBA
2.一个峰或几个峰是负峰WUt检测VBA
流动相吸收本底高;进样过程中进入空气;样品组分的吸收低于流动相。WUt检测VBA
3.所有峰均为负峰WUt检测VBA
信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒;光学装置尚未达到平衡。WUt检测VBA
4.所有峰均为宽峰WUt检测VBA
系统未达到平衡;溶解样品的溶剂极性比流动相差很多;色谱柱尺寸及类型选择不正确;色谱柱或保护柱被污染或柱效降低;温度变化造成的影响。WUt检测VBA
5.所出峰比预想的小WUt检测VBA
样品黏度过大;进样品故障或进样体积误差;检测器设置不正确.定量环体积不正确;检测池污染;检测器灯出现问题。WUt检测VBA
6.出现双峰或肩峰WUt检测VBA
进样量过大;样品浓度过高;保护柱或色谱柱柱头堵塞;保护拄或色谱柱污染或失效;柱塌陷或形成短通道。WUt检测VBA
7.前伸峰WUt检测VBA
进样量或样品浓度高，溶解样品的溶剂较流动相极性强;保护柱或色谱柱污染或失效。WUt检测VBA
①柱温低：升高柱温;②样品溶剂选择不恰当：使用流动相作为样品溶剂;③样品过载：降低样品含量;④色谱柱损坏：更换柱子。WUt检测VBA
8.拖尾峰WUt检测VBA
柱超载，降低样品量;增加柱直径采用较高容量的固定相;峰干扰，对样品进行清洁过滤;调整流动相;硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值;柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢;加在线过滤器，对样品进行过滤;死体积或柱外体积过大，将连接点降至谷值;尽可能使用内径较细的连接管;柱效下降，更换柱子;采用保护柱，对柱子进行再生。WUt检测VBA
9.出现平头峰WUt检测VBA
检测器设置不正确;进样体积太大或样品浓度太高。WUt检测VBA
10.出现鬼峰WUt检测VBA
进样阀残余峰，可能为上次样品的残余。在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统;样品中存在未知物，改进样品的预处理;流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤;尽可能使用HPLC级试剂;流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。WUt检测VBA
11.峰分叉WUt检测VBA
①保护柱或分析柱污染：取下保护柱再进行分析,如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。②样品溶剂不溶于流动相改变样品溶剂,如果可能采取流动相作为样品溶剂。WUt检测VBA
12.峰变形WUt检测VBA
样品过载，减少样品载量。WUt检测VBA
13.早出的峰变形WUt检测VBA
样品溶剂选择不恰当 ①减少进样体积 ②运用低极性样品溶剂WUt检测VBA
14.早出的峰拖尾程度大于晚出的峰WUt检测VBA
柱外效应 ①调整系统连接(使用更短、内径更小的管路) ②使用小体积的流通池WUt检测VBA
15.酸性或碱性化合物的峰拖尾WUt检测VBA
缓冲不合适①使用浓度50～100 mM的缓冲液②使用Pka等于流动相pH值的缓冲液WUt检测VBA
16.额外的峰WUt检测VBA
(1)样品中有其他组分：正常现象;WUt检测VBA
(2)前一次进样的洗脱峰：①增加运行时间或梯度斜率②提高流速;WUt检测VBA
(3)空位或鬼峰：①检查流动相是否纯净 ②使用流动相作为样品溶剂 ③减少进样体积。 潮湿环境中如何维护液相色谱仪WUt检测VBA 操作人员最关心的是分析结果，而检测器是HPLC的眼睛。由于很多时候天气潮湿，很容易使检测器精密的光学部件性能受到影响，导致灵敏度下降或波长检验通不过，更严重者：灯电路板、预放大板及CPU板同时被短路击坏。而这类情况在干燥的北方地区则比较少。由此可见，潮湿气候对仪器损害之大。WUt检测VBA 在多雨季节到来之前，勿请用户将液相色谱仪调整放置在通风条件好，湿度低(<70%)的实验室内。同时，给实验室配备去湿机、空调及通风装置。表面上看，虽然增加了支出，但您的实际回报将大大超出您的支出。
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