液相方法开发攻略 - 弹：实现保留
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液相方法开发攻略kx6检测VBA
弹：实现保留kx6检测VBA
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今天要为大家带来一个新干货系列——液相方法开发攻略！kx6检测VBA
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在进行液相色谱分析时，我们通常有以下诉求：kx6检测VBA
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而在液相分析工作中，液相方法的开发一直是一项比较具有难度的工作，不论是新手小白，还是有经验的实验室老师，在面对新项目的方法开发时，总会遇到一些问题。kx6检测VBA
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因此，YoYo特意把大曹三耀技术中心多年来积累总结的经验，梳理汇总为这一系列液相方法开发攻略，并将围绕以下四个方面展开介绍：kx6检测VBA
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★ 实现保留kx6检测VBA
★ 实现分离kx6检测VBA
★ 峰形和理论塔板数kx6检测VBA
★ 寿命kx6检测VBA
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今天先来介绍重要也是关键的弹——实现保留，后续几篇将在今后陆续推送，敬请期待哟~kx6检测VBA
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由于大部分化合物都可以在反相分析模式下，使用反相C18色谱柱进行分析与保留，因此，在建立新方法时，反相C18色谱柱也是优先选择的色谱柱。一般可以按照以下步骤进行调整：kx6检测VBA
反相C18柱初筛 看是否有保留kx6检测VBA
提问：方法初筛时，选择什么样的C18色谱柱比较好？kx6检测VBA
YoYo老师：选择一款普适型色谱柱，要求硅胶纯度高、金属杂质低、具有适中的疏水性与表面极性，能分析大多数常规化合物，峰形好、寿命长，分离度高，柱效高~kx6检测VBA
这些要求很过分吗？不！kx6检测VBA
这是我们对CAPCELL PAK C18 MGII色谱柱的基本要求！kx6检测VBA
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CAPCELL PAK C18 MGIIkx6检测VBA
CAPCELL PAK C18 MG系列色谱柱凭借填料表面致密的聚合物包被技术，极大程度地抑制了硅胶基材的金属杂质及残留硅醇基等不良影响，CAPCELL PAK系列色谱柱具有以下特长：kx6检测VBA
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★ 极大限度地减少配位化合物的吸附kx6检测VBA
★ 极大限度地抑制残留硅醇基的二次效应kx6检测VBA
★ 优越的耐酸、耐碱性能kx6检测VBA
★ 能得到对称性良好的色谱峰kx6检测VBA
★ 具备良好的保留与分离能力kx6检测VBA
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其中，CAPCELL PAK C18 MGII色谱柱是普适性很强的C18色谱柱，可以满足大部分化合物的分析需求。kx6检测VBA
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那么，在经过C18色谱柱初筛之后，还是发生了保留不充分的情况，应该如何调整分析方法来实现保留呢？kx6检测VBA
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调整pH值kx6检测VBA
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在反相模式下，对于不同性质的化合物也应采取不同的流动相条件及相应色谱柱。例如，酸性化合物在酸性条件下保留较强，碱性化合物在碱性条件下保留较强，利用这一性质，调整适合的pH值，并选择相应适合的色谱柱，即可达到良好保留结果。kx6检测VBA
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在设定流动相pH时需要注意：离子性化合物可能会由于流动相pH值设定的不合理而发生漂移，建议将流动相的pH值设定在化合物的pKa±2以上范围。kx6检测VBA
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更换保留模式kx6检测VBA
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如果调整流动相pH也不能解决保留问题，该化合物可能不适合在反相模式下进行保留和分析，这时，可以考虑更换保留模式进行进一步的方法摸索。kx6检测VBA
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★ 离子交换模式（离子对试剂、离子交换柱）kx6检测VBA
★ HILIC模式kx6检测VBA
★ 正相模式kx6检测VBA
色谱柱的选择kx6检测VBA
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对于强极性、小分子类化合物，可以使用高极性反相柱或在HILIC模式下进行保留尝试kx6检测VBA
★ 高极性反相柱：AQ、ADMEkx6检测VBA
★ HILIC（亲水性相互作用）柱：PC HILIC、NH2、SILICAkx6检测VBA
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对于酸性化合物，可以使用阴离子交换柱或反相柱+正离子对试剂的方法，使酸性化合物处于分子态，利于增强保留kx6检测VBA
★ 阴离子交换柱：NH2kx6检测VBA
★ 反相柱+正离子对试剂：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18kx6检测VBA
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对于碱性化合物和两性化合物，可以尝试使用阳离子交换柱或反相柱+负离子对试剂的方法，使碱性化合物处于分子态，增强保留kx6检测VBA
★ 阳离子交换柱：SCX、CRkx6检测VBA
★ 反相柱+负离子对试剂：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18kx6检测VBA
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分离模式选择例kx6检测VBA
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接下来，YoYo将以三聚氰胺的分析为例，对保留困难的化合物的方法建立进行说明。kx6检测VBA
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三聚氰胺俗称蜜胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，为重要的氮杂环有机化工原料，有毒，不可用作食品加工和食品添加剂，pKa=8，属于弱碱性化合物。kx6检测VBA
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三聚氰胺kx6检测VBA
Melaminekx6检测VBA
M.W. :126.12kx6检测VBA
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（一）离子交换模式kx6检测VBA
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在离子交换模式下进行分析，能对三聚氰胺得到良好保留。具体做法可分为以下两种：kx6检测VBA
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1. 反相色谱柱 + 离子对试剂kx6检测VBA
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▲CAPCELL PAK C18 MG+离子对试剂kx6检测VBA
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HPLC Conditions (Refer to GB/T 22388-2008):kx6检测VBA
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Column: CAPCELL PAK C18 MG S5; 4.6 mm i.d. × 250 mmkx6检测VBA
M.Phase: 10 mM citric acid, 10mM SOS (pH 3.0 adjusted with NaOH) / CH3CN = 90 / 10kx6检测VBA
Flow rate: 1 mL/minkx6检测VBA
Oven Temp.: 40°Ckx6检测VBA
Detector: UV 240 nmkx6检测VBA
Sample: Melamine in M.P.kx6检测VBA
Inj. Vol.: 20 μLkx6检测VBA
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2. 离子交换色谱柱分析kx6检测VBA
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▲CAPCELL PAK SCX色谱柱kx6检测VBA
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HPLC Conditions:kx6检测VBA
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Column: CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6 mm i.d. × 150 mmkx6检测VBA
M.Phase: 50 mM KH2PO4 (pH 3.0 adjusted with H3PO4) / CH3CN = 70 / 30kx6检测VBA
Flow rate: 1 mL/minkx6检测VBA
Oven Temp.: 30°Ckx6检测VBA
Detector: UV 240 nmkx6检测VBA
Sample: Melamine in M.P.kx6检测VBA
Inj. Vol.: 20 μLkx6检测VBA
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CAPCELL PAK SCXkx6检测VBA
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CAPCELL PAK SCX是一款解决了传统硅胶系离子交换柱存在的问题的聚合物包被型强阳离子交换色谱柱。在精密分级的5 μm的高纯度硅胶上形成高分子聚合物包被后，导入磺酸基。聚合物包被型的Si-C结合比一般的化学结合型硅胶系SCX的Si-O-Si结合更稳定，耐久性更强。kx6检测VBA
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★ 通过强阳离子交换作用和疏水性相互作用的共同保留机制来进行保留kx6检测VBA
★ 批次间重现性良好kx6检测VBA
★ 耐久性强kx6检测VBA
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不论是反相柱+离子对试剂，还是使用离子交换色谱柱进行分析，都会发现色谱柱平衡时间对保留时间的影响。在离子交换模式下进行分析时，需要充分平衡色谱柱，建议小流速过夜平衡，可以得到比较稳定的实验结果。kx6检测VBA
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（二）高极性反相色谱柱kx6检测VBA
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键合金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME色谱柱，兼具高表面极性和一定的疏水性，不仅适用于强极性物质的保留，也适用于强极性物质和疏水性物质的多组分共同分析。kx6检测VBA
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使用键合独特金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME色谱柱，在简单的2%甲醇条件下即可实现三聚氰胺和双氰胺的良好保留与分离。这得益于ADME色谱柱独特的表面极性与保留模式。kx6检测VBA
▲CAPCELL PAK ADME分析三聚氰胺与双氰胺结果kx6检测VBA
*峰1：双氰胺，峰2：三聚氰胺kx6检测VBA
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HPLC Conditions:kx6检测VBA
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色谱柱：CAPCELL PAK ADME S5; 4.6 mm i.d. × 250 mmkx6检测VBA
流动相：2% CH3OHkx6检测VBA
流 速：1000µL / minkx6检测VBA
温 度：35°Ckx6检测VBA
检 测：PDA210 nmkx6检测VBA
进样量：5 µLkx6检测VBA
样 品：10 μg/mL（流动相溶解稀释）kx6检测VBA
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CAPCELL PAK ADMEkx6检测VBA
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CAPCELL PAK ADME色谱柱采用独特的立体笼状金刚烷基官能团——ADME官能团，突破了以C18官能团为主的传统柱在反相保留机理中的可分析化合物的限制，使可分析化合物的极性范围得到了巨大的提升；并且，在极性提升的同时还兼顾一定的疏水性；从而，包含从强极性化合物到疏水性化合物的复杂组分样品在ADME上也能同时得到良好的保留。kx6检测VBA
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★ 立体笼状金刚烷基官能团——独特的独特的表面极性与疏水性平衡kx6检测VBA
★ 高表面极性——对强极性化合物的良好保留kx6检测VBA
★ 兼顾一定疏水性——从极性到疏水性化合物的共同分析kx6检测VBA
★ 立体选择性——空间异构体拆分能力kx6检测VBA
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ADME(adamantane)金刚烷，我们将这种笼状结构的金刚烷基团以控制的键合密度导入填料表面，通过“新型官能团”和特有的包被型填料表面“控制技术”，我们将保持疏水性又提高表面极性变为可能；由于金刚烷特有的笼状结构所带来的立体选择性，还赋予了ADME分离结构类似化合物的能力。kx6检测VBA
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（三）亲水性相互作用 HILIC模式kx6检测VBA
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亲水性相互作用色谱法（HILIC）是针对在常规C18色谱柱上保留较弱的强亲水性物质的保留方法。在HILIC模式下，通过键合极性官能团的固定相与反相模式常用的CH3CN / H2O系流动相条件相组合，对亲水性化合物进行保留与分离。因此，HILIC是在HPLC的分离模式中常使用的反相模式的反相，故也被称为“反反相模式”。kx6检测VBA
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大阪曹達独立研发合成了构成细胞膜的主要磷脂类物质之一的卵磷脂亲水性部位——PC基团（磷酸胆碱基团），作为PC HILIC色谱柱的官能团，对亲水性化合物的保留具有优势。kx6检测VBA
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如下图，使用PC HILIC色谱柱和另一款其他品牌色谱柱Column B进行对比，对三聚氰胺进行分析，在10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10（pH = 3.0）条件下，PC HILIC色谱柱所得保留时间更长，理论塔板数更高，即使是在水相比例为20%时，也得到了足够的保留。kx6检测VBA
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▲PC HILIC色谱柱在不同条件下分析结果kx6检测VBA
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HPLC Conditions：kx6检测VBA
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Column : PC HILIC 4.6 mm i.d. x 250 mmkx6检测VBA
Mobile phase : 10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10, pH = 3.0kx6检测VBA
Flow rate : 1.0 mL/minkx6检测VBA
Temperature : 40 ˚Ckx6检测VBA
Detection : UV 235 nmkx6检测VBA
Inj. vol. : 10 μLkx6检测VBA
Sample dissolved in: Mobile phasekx6检测VBA
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PC HILICkx6检测VBA
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大阪曹達独立研发合成了构成细胞膜的主要磷脂类物质之一的卵磷脂亲水性部位——PC基团（磷酸胆碱基团），作为PC HILIC色谱柱的官能团，对亲水性化合物的保留具有优势。kx6检测VBA
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★使用超亲水性的磷酸胆碱基团作为官能团的HILIC色谱柱kx6检测VBA
★随乙腈含量增加，保留增大，通常70%乙腈kx6检测VBA
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（四）LC-MS分析——混合模式保留kx6检测VBA
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MS检测对流动相的要求：kx6检测VBA
★ 不含离子对试剂kx6检测VBA
★ 挥发性盐，低浓度kx6检测VBA
阳离子交换填料柱 + 挥发性盐溶液（低浓度）kx6检测VBA
SCX + C18 = CR ！kx6检测VBA
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在以MS检测器进行分析时，流动相条件会对灵敏度产生很大影响，CAPCELL PAK CR色谱柱混合了C18和强阳离子交换SCX填料，即使对多种碱性化合物进行同时分析，也能兼顾对保留和MS检测灵敏度的要求。kx6检测VBA
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如上图，在中性条件下：kx6检测VBA
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● C18色谱柱：中性化合物得到保留，酸性、碱性化合物快速出峰；kx6检测VBA
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● SCX色谱柱：碱性化合物得到保留，中性、酸性化合物快速出峰；kx6检测VBA
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● 混合了两种填料的CR色谱柱：碱性化合物得到保留，中性化合物能得到适度保留，酸性化合物依然快速出峰。kx6检测VBA
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此时，只需将流动相条件调整为酸性，即可在CR色谱柱上同时保留这三种类型的化合物：kx6检测VBA
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HPLC Conditions：kx6检测VBA
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Column ：CAPCELL PAK CR S5 1:4 ; 2.0 mm i.d. × 150 mmkx6检测VBA
Mobile Phase：1.0 vol% CH3COOH,kx6检测VBA
25 mmol/L CH3COONH4 / CH3CN = 50 / 50kx6检测VBA
Flow rate ：200 µL/minkx6检测VBA
Temp ：40 ℃kx6检测VBA
Detection ：UV 240 nmkx6检测VBA
Injection ：2 µLkx6检测VBA
Sample ：10 µg/mLkx6检测VBA
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CAPCELL PAK CRkx6检测VBA
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CAPCELL PAK CR色谱柱是一款混合C18和强阳离子交换SCX填料的色谱柱。对多种碱性化合物进行同时分析时，能同时兼顾对保留和MS检测灵敏度的要求。kx6检测VBA
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★ 强阳离子交换SCX与C18混合填料kx6检测VBA
★ 具有独特分离模式kx6检测VBA
★ 适合于LC-MS的高灵敏度离子化合物分析kx6检测VBA
★ 可对酸性、中性、碱性化合物进行同时保留kx6检测VBA
★ 有3种混合比例可供选择kx6检测VBA
*与武田制药共同开发kx6检测VBA
通过调整流动相的盐浓度，可在离子交换作用下针对碱性化合物的保留程度进行调整，从而改变分离模式，达到不同极性化合物同时分析的效果。kx6检测VBA
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将柱子接通载气，流速5～10ml/min，在高于使用温度5～10℃(但必须低于柱子使用限制温度)下老化8～24小时，目的是去除装柱时的残留溶剂，使固定液分布均匀，提高柱效。老化时必须将柱子与检测器的连接断开以免污染检测器kx6检测VBA
1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。kx6检测VBA
4、选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解，压力升高是需要更换预柱的信号。kx6检测VBA
5、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处 理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。kx6检测VBA
6、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50～75ml。kx6检测VBA
10、每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱，好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。kx6检测VBA
