如何保护高效液相色谱柱以提高其使用寿命液相色谱操作规程

时间：2025-04-14 10:10:07 来源：作者：

【客服微信qejc21】色谱柱用久后常出现柱压升高，柱效降低，峰形畸变，保留时间改变等变化，如不采取适当措施，色谱柱将无法再使用，缩短色谱柱的使用寿命。在高效液相色谱仪的使用中

色谱柱用久后常出现柱压升高，柱效降低，峰形畸变，保留时间改变等变化，如不采取适当措施，色谱柱将无法再使用，缩短色谱柱的使用寿命。在高效液相色谱仪的使用中，保持高效液相色谱柱的柱效、容量和渗透特性，延长柱子的使用寿命非常重要。fJR检测VBA

1、流动相对色谱柱的损害因素fJR检测VBA

颗粒杂质:目前广泛使用的柱填料直径多在10um以下，微小的颗粒杂质很容易使柱子发生堵塞，因此使用的溶剂应当过滤，柱子上端接头应当装微孔过滤片以阻挡颗粒物进入柱中。fJR检测VBA

水溶液中的微生物:以水溶液为流动相时，应防止细菌的生长，五氯酚、叠氮化钠、辛酸等能防止细菌生长。当用水溶液或有机酸缓冲液保护柱子时，一些厌氧霉菌可能在色谱柱中滋生，堵塞固定相颗粒间的空隙。fJR检测VBA

pH值:对硅胶基键合相填料，水溶液pH值不可超过2-7.5这一范围，当pH>8时，硅胶会释出fJR检测VBA

生成絮状物堵塞柱子，且难以复原，柱效很快降低，甚至完全失效。fJR检测VBA

盐类析出:当在流动相缓冲液中加入和水混溶的有机溶剂时，其中的盐类溶解度下降，可析出盐类沉淀，堵塞柱子;加入粘度不同的样品溶液也可能发生类似现象。所以缓冲液中盐的浓度宜低，样品提取液的组成应和流动相匹配。fJR检测VBA

2、样品对色谱柱的损害因素fJR检测VBA

杂质堵塞:样品中的微粒同样会使柱子堵塞，样品也应进行过滤处理。fJR检测VBA

样品组分的不可逆吸附:通常被吸附的组分有蛋白质、醣等，可以采取加装保护柱，或使用适应的溶剂反冲来处理。常用溶剂有四氢呋喃(适用于溶解有机高聚物和工业样品中的焦油)、高浓度的脲或盐酸胍溶液(使蛋白质改性而洗脱)、高离子强度的磷酸盐缓冲液(pH=7，适合反相柱和离子交换柱，可除去蛋白质和醣等)。fJR检测VBA

样品组分与固定相反应:这种反应对NH2柱的影响较严重，NH2易和酐、酮形成希夫(Schiff)缩合而减少活性点，使保留时间缩短，因此羰基化合物样品和流动相(如丙酮、乙酸乙酯等)不宜使用NH2柱。fJR检测VBA

活性点被覆盖:由于固定相吸附样品中的组成或杂质而使活性点被覆盖，在柱压升高的同时保留时间减少，将样品过滤或使用萃取分离柱(对大分子有机物如蛋白质、白细胞等)效果较好。fJR检测VBA

3、色谱柱固定相的化学变化fJR检测VBA

色谱柱固定相分解、活性基团变性以及键合相基团脱落会使保留时间显著变化。fJR检测VBA

1、键合相基团脱落fJR检测VBA

绝大多数键合相都是通过硅氧硅键(Si-O-Si)连接在硅基质上，形成带有机基团的固定相Si-O-Si-R(R为、G18H37、C8H17、CnH2n+1)。硅氧硅键可在水溶液中水解而断裂，使键合相基团脱落，对C2和NH2柱键合相基团脱落不可忽视。为减少或防止基团脱落，可增加流动相的有机溶剂量，降低离子强度和pH值，对基团已脱落的固定相，可用合适的硅烷试剂再生。fJR检测VBA

2、固定相分解或活性基团变性fJR检测VBA

例如氰基柱的保留时间显著缩短，但键合相中C、H、N的百分含量并无大变化，证明未发生—CN水解成-COOH反应，而是形成了衍生物。在硅上增加烷基可减少水解。fJR检测VBA

4、高效液相色谱柱的保养fJR检测VBA

色谱柱在使用一段时间后，常遇到柱子受污染，柱效下降的问题，采用适当的方法对色谱加以保护和再生，能够延长色谱柱的使用寿命。fJR检测VBA

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　　【中国检测VBA 维修保养】液相色谱仪是利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异，对混合物进行先分离，而后分析鉴定的仪器。

　　一、泵的使用和维护
　　
　　1、防止固体微粒进入泵内。因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞杆、密封环、缸体和单向阀。泵的入口都应连接砂滤棒，输液棒的滤器经常清洗或更换。
　　
　　2、流动相不应含有任何腐蚀性物质。例如氯仿、丙酮、二氯甲烷等，这些溶剂将会Peek树脂部件变脆；还有含有卤离子的流动相或能产生卤离子的流动相，如果使用了，分析结束后，应立即用去离子水清洗整个管路，因卤离子会腐蚀不锈钢部件或管路。流动相含有缓冲盐不应停泵保留在泵内时间过长，由于蒸发甚至由于溶液的净置就可能析出晶体。
　　
　　3、泵工作时要注意流动相不要被用完，否则空泵运转会加快磨损柱塞杆和密封圈。输液泵的压力不要太高，否则会使密封圈变形，降低密封圈使用寿命。
　　
　　4、在使用双泵过程中，如果不是梯度洗脱，尽量先混合。如果一个是有机溶剂，一个是含盐溶液，在用双泵的时候，有可能会析出晶体。
　　
　　5、在使用缓冲盐作流动相实验结束之前和结束后，都要用含10％甲醇水溶液冲洗管路，不能用纯水冲洗，因纯水会对柱子造成损坏。进样阀要用适宜的溶剂进行清洗。
　　
　　二、色谱柱的使用和维护
　　
　　1、避免压力和温度的急剧变化以及机械震动。在进样的时候，进样阀扳手不能转动太慢，更不能停留在中间，如停留在中间，泵内压力剧增，这时再转动到进样位置时，过高的压力会损坏色谱柱。如出现机械震动（掉在地上）则会改变填料的充填状态。
　　
　　2、在使用色谱柱过程中，不应直接从有机溶剂到水，反之，也不要从水直接改变到有机溶剂。
　　
　　3、色谱柱一般不能反冲，除非生产者指明。
　　
　　4、冲洗色谱柱时，每种溶剂至少冲洗50ml。
　　
　　5、装在机子上的色谱柱，应每隔4～5天冲洗15分钟，可以避免长菌，保护色谱柱。
　　
　　6、PH的调节尽量在2～9之间
　　
　　7、保存色谱柱时，柱接头要拧紧。
　　
　　三、输液泵产生故障及排除方法
　　
　　1、没有流动相流出，又无压力显示。原因可能是泵内有大量气体，这时打开排液阀，使泵在较大流量下运转，将气体排出，也可用一个针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个原因使密封圈损坏。
　　
　　2、压力和流量不稳。原因①可能有气泡；②单向阀污染，可卸下单向阀，浸入异丙醇内超声清洗；③沙滤棒内有杂质或微生物堵塞，可将沙滤棒浸入流动相中超声清洗，也可将滤头放入4mol/l硝酸溶液中，迅速除去微生物。也可能是盐堵塞，可放入水中清洗；④在线过滤器堵塞⑤进样阀损坏；⑥密封圈性能不好。
　　
　　3、压力过高。①管路堵塞；②保护柱堵塞；③检测池堵塞，发生情况立即停泵，否则会损坏流通池。
　　
　　四、与检测器有关的故障及其排除
　　
　　1、流通池内有气泡。如果有气泡连续不断通过检测池，将其噪音增大。如有较大气泡，则会在基线上出现许多线状“峰”，可加大流量排出气体。如果检测池有停留的气泡，可采用突然增大流量的方法排除气体（不连接色谱柱）。
　　
　　2、检测池被污染。检测池被污染了，可能产生噪音，或基线漂移，可以使用适当溶剂清洗，如果污染严重，就可以用1mol/l硝酸溶液、水和新鲜溶剂进行清洗。
　　
　　3、光源灯出现故障。检测器的光远灯不能满足正常样品分析时，可能产生严重噪音污染，基线漂移，出现异常峰，甚至基线不回零。
　　
　　4、出现倒峰。如果流动相有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，就会产生倒峰，必须用高纯度的溶剂作为流动相。检测器的极性接反了，也会出现倒峰。

高效液相色谱仪的系统组成与特点

　　高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。

　　1.进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。fJR检测VBA

　　2.输液系统该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47～4.4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获得有效分离。fJR检测VBA

　　3.分离系统该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm(需要两根连用时，可在二者之间加一连接管)，内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成).固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000?)和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样)，或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。fJR检测VBA

　　另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。fJR检测VBA

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